BIOMATRIX.SU

Аннотация проекта:

Современные тенденции развития биологии и медицины лежат в плоскости биоинженеринга. Развитие нано- и клеточных технологий на международном уровне позволяет говорить о широких перспективах
симбиоза этих двух направлений для создания эффективного биосовместимого пластического материала требуемых свойств (устойчивость, длительность существования в организме), а также органов, нуждающихся в каркасной основе. На сегодняшний день медицина в целом и хирургия в частности нуждаются в инновационных видах пластического материала для биоинженеринга с целью решения сложных реконструктивных проблем. В мире существуют разработки в данном направлении, аналогов которых в России нет (ацеллюлярный матрикс и др.). Что касается создания трехмерных нанобиоконструкций, то эти разработки считаются перспективными, однако конкретных результатов не описано. Необходимость отечественных разработок в данном направлении очевидна. Создание собственных биосовместимых материалов нового поколения с перспективой формирования нанобиоконструкций позволит существенно модернизировать подходы к лечению заболеваний в различных областях медицины. В частности речь идет о получении нового продукта, по своим физико-биологическим характеристикам приближающегося к структурам человеческого тела. Упругость материала позволит моделировать форму и размеры интраоперационно, создавать 3D-формы и пространственно ориентированные структуры. Модификация материала с помощью технологий плазматронного и магнитотронного напыления позволит увеличить биосовместимость и безопасность полученной матрицы.

Фундаментальная научная проблема, на решение которой был направлен проект, заключается в создании биоконструкций с использованием межклеточного матрикса, которые могут лечь в основу формирования пластического материала заданных свойств, в том числе, эквивалентов тубулярных органных структур.За время реализации проекта были выполнены следующие работы:1) Изучено и проанализировано состояние мировых исследований по данному направлению. 2) На основании исследований выбран материал для создания 3D каркаса межклеточного матрикса с целью формирования трубчатых биоконструкций с использованием эпителиальных клеточных элементов – наноструктурированный никелид титана в виде проволоки диамером 20 мкм и его аналог из титана 3) Проведено исследование поверхности волокон из титана и никелида титана, как в исходном состоянии, так и после нескольких вариантов очистки и нанесения биоактивного покрытия. 4) Разработаны и изготовлены образцы – прототипы сетки в виде волокон, намотанных с определенным шагом на титановые рамки. 5) Произведена ионная очистка части образцов с нанесением на некоторые из них покрытия TiCaPCON первичного тестирования на адгезию и пролиферацию клеток in vitro. 6) Произведено первичное тестирование различных модификаций 3D-наноконструкций на основе никелида титана с разной степенью очистки и напыления на адгезию и пролиферацию клеток с использованием клеточных культур мезенхимального и эпителиального происхождения.В результате проведенных исследований выявлено, что для создания трехмерных биосовместимых наноконструкций на основе никелида титана необходима ионная очистка, которая обеспечит удаление токсичных примесей и оптимальные адгезионные свойства поверхностей нитей; две стандартных линейных культуры клеток (эпителиальные и мезенхимальные) способны формировать монослой на поверхности нитей в условиях in vitro при культивировании; очищенные наноконструкции на основе никелида титана с биоактивным покрытием пригодны для создания тканеинженерных конструкций. На следующем этапе выполнения проекта была разработана титановая сетка 3-D плетения с последующей ионной очисткой и нанесением биоактивного покрытия TiCaPСON для ее подготовки к  использованию в качестве каркаса межклеточного матрикса. Разработан прототип межклеточного матрикса с усиленной каркасной функцией на основе использования очищенной титановой сетки объемного плетения с коллагеновым наполнителем.Нами предложен оригинальный способ формирования сэндвичевых структур на основе титановой сетки и реструктурированного коллагена. Полученные с помощью этого способа материалы сформированы однородно, а каркасная структура полностью покрыта коллагеном. Предложенный способ модификации титановой сетки позволяет в дальнейшем формировать сплошные эпителиальные выстилки, тогда как высаживание клеток на исходную сетку приводило только к адгезии единичных клеток к материалу. Измерения полученных материалов на разрыв показало уникальную особенность сформированных матриц, заключающуюся в том, что при ее растяжении создается напряжение локально, в наиболее слабых узлах плетения; что, как следствие, приводит к локальным разрывам без отделения коллагена от армирующей структуры во всем объеме. Из выше изложенного следует, что именно такой материал может служить основой для замещения участков тканей, подвергающихся регулярным механическим нагрузкам. Анализ модуля Юнга исходной сетки и гибридной матрицы показал, что в обоих случаях он одинаковый (определяется модулем Юнга титановой сетки), при этом и относительное удлинение, и удлинение разрыва определяется коллагеновой пленкой и значительно падает при переходе от исходного материала к сформированной матрице. Разработаны и подготовлены прототипы тубулярных биоконструкций, на поверхности части из них в лабораторных условиях были культивированы стволовые клетки. Методом микроскопии было подтверждено отсутствие токсического влияния основного материала биоконструкции, выражающееся в активном росте клеточного материала на поверхности тестируемых прототипов. В дальнейшем из буккального эпителия человека была получена первичная монослойная культура, из которой были сформированы сфероиды и нанесены на поверхность гибридного матрикса с последующей культивацией. В результате получено хорошее однородное распластывание клеток по поверхности и с морфологическим воспроизведением натуральной ткани уретры, как одного из примеров полого органа.  В ходе работы проведен лабораторный эксперимент, для которого из полученных прототипов биоконструкций созданы полые трубчатые имплантаты. На поверхности трубчатых конструкций культивированы стволовые клетки используемых в последующем лабораторных животных, в дальнейшем имплантированные в организм крыс линии Wistar на срок от 3 до 6 месяцев. По истечении вышеуказанных сроков, лабораторные животные выводились из эксперимента, имплантированные ранее структуры подвержены морфологическому, цитологическому и гистологическому исследованиям. Экспериментальное исследование подтвердило, что созданные прототипы тубулярных структур обладают заданными каркасно-опорными характеристиками, обладают достаточной упругостью и способностью удерживать заданную трубчатую форму. Таким образом, в представленной работе показана принципиальная возможность использования гибридной матрицы на основе титановой сетки и коллагена для создания однородного многослойного эпителия с применением технологии клеточных сферойдов. Показано, что сформированная поверхность коллагена, однородная, механически стабильная и структурированная, что дополнительно позволяет формировать сплошную эпителиальную выстилку. Следует отметить, что разработанный материал может использоваться не только как поддерживающий материал в реконструктивных операциях, но и являться самостоятельной матрицей-носителем, в том числе, для восстановления тканей подвергающихся постоянным нагрузкам и служить прототипом полых органов.

Bioengeneering is an important science in modern biology and medicine. The development of nano- and cellular technologies allows us to understand the broad prospects for symbiosis of these two areas. We can create effective biocompatible reconstructive material with necessary properties (stability, longetivity). We can develop organs that with a frame structure basis. The fundamental scientific problem which this project was designed to solve, is to create biocompatible nanostructures using extracellular matrix. The developement of biosynthetic materials with specific properties, including equivalents of tubular organs is a demanding area of reasearch. The following tasks were accomplished:1) current trends in bioengineering were systematically analyzed. 2) a 3D framework for the creation of an extracellular matrix to form tubular bioconstructions using epithelial cellular elements was chosen: wired nanostructured titanium nickelide with a diameter of 20 μm and its titanium analogue. 3) Both titanium nickelide and pure titanium structures were studied both in the initial state, and after several methods of cleaning and applying a bioactive coating. 4) Biostructure samples were designed and manufactured as prototypes of the biogrid in the form of fibers, wound onto a titanium frame. 5) An ionic cleaning of part of the samples was carried out with application of TiCaPCON coating on some of them, with preliminary testing of the adhesion and proliferation of cells in vitro. 6) Testing of various modifications of 3D nanoconstructions based on titanium nickelide with different degrees of purification and cell adhesion and proliferation of cell cultures of mesenchymal and epithelial origin was carried out.As a result of the experimental study, it was revealed that the creation of three-dimensional biocompatible nanoconstructions based on titanium nickelide requires ionic cleaning, which will ensure the removal of toxic impurities and account for optimum adhesive properties of the filament surface; two standard linear cell cultures (epithelial and mesenchymal) are capable of forming a monolayer on the surface of the filaments under in vitro conditions during cultivation. Purified nickel-based titanium with bioactive coating is suitable for creating tissue bioengineered structures.At the next stage of the project, a 3-dimensional titanium mesh  was developed, which was consequently subdued to ionic cleaning and application of TiCaPСON bioactive coating to prepare it for use as an intercellular matrix framework. A prototype of the extracellular matrix with an enhanced frame function based on purified titanium mesh with collagen filler was developed.We have proposed an original method of forming "sandwich" structures based on titanium mesh and restructured collagen. Obtained using this method, the materials are formed uniformly, and the frame structure is completely covered with collagen. The proposed method of modifying the titanium mesh allows you to further form a solid epithelial lining, whereas planting cells onto the original mesh only led to adhesion of single cells to the material.Measurements of the obtained materials to withcstand force showed the fact that when it is stretched, tension is generated locally, in the weakest weaving points; which, as a result, leads to local breaks without separation of collagen from the reinforcing structure in its entirety. Such a material can serve as a basis for the replacement of sections of tissue subjected to regular mechanical force. Analysis of Young's modulus of the original grid and the hybrid matrix showed that in both cases it is the same (determined by the Young modulus of the titanium mesh), and the relative elongation and elongation of the gap is determined by the collagen film - it decreases significantly when passing from the source material to the formed matrix.Prototypes of tubular bioconstructions were developed and prepared, stem cells were cultured on the surface of several of them under laboratory conditions. Via microscopy we confirmed the absence of toxic effect of the base material, expressed in the active growth of cellular material on the surface of the tested prototypes.Subsequently, a primary monolayer culture was obtained from the human buccal epithelium, from which spheroids were formed and applied to the surface of the hybrid matrix with subsequent cultivation. As a result, a good homogeneous cell spreading on the surface with the morphological reproduction of the natural tissue of the urethra was obtained.
In the course of the experiment we managed to developprototypes of bioconstructions and create hollow tubular implants. On the surface of tubular structures stem cells were cultured and used in the subsequent experiment of laboratory animals when implanted to Wistar rats for a period of 3 to 6 months. 3 to 6 months after implantation, the laboratory animals were removed from the experiment, previously implanted structures were subject to morphological, cytological and histological studies after extraction. This experimental study confirmed that prototypes of tubular structures have given frame-supporting characteristics, and have sufficient elasticity and ability to retain a given tubular shape. Therefore in the presented work the principal possibility is shown that using a hybrid matrix based on titanium and collagen mesh is possible to create a homogeneous multilayered cellular structure.It is shown that the uniformed collagenous structure is mechanically stable and structured, which additionally allows for the formation of a solid epithelial lining. It should be noted that the bioengeneered material can be used not only as a supporting material in reconstructive operations, but also as a self-supporting matrix for restoration of tissues subjected to constant load and serve as a prototype for hollow organ biodevelopement.

Общая Цель исследования: Cоздание биоконструкций с использованием межклеточного матрикса, которые могут лечь в основу формирования пластического материала заданных свойств, в том числе, эквивалентов тубулярных органных структур.

Задачи исследования:

1) Провести анализ современного состояние научной проблемы по данным литературы.

2) Исследовать биосовместимые материалы для создания 3D каркаса межклеточного матрикса с целью формирования трубчатых биоконструкций с использованием эпителиальных клеточных элементов.

3) Осуществить обоснованный выбор материалов  для создания межклеточного матрикса.

4) Изучить, подготовить и обработать основные компоненты каркаса межклеточного матрикса.

5) Создать 3D каркас межклеточного матрикса и сформировать трубчатые биоконструкции с использованием клеточных элементов.

6)  Произвести тестирование различных модификаций каркаса межклеточного матрикса на адгезию и пролиферацию клеток с использованием различных клеточных культур.

7) Выполнить тестирование биодоступности, безопасности, а так же требуемых конструктивных задач и свойств разработанных трубчатых биоинженерных конструкций in vivo (в организме лабораторных животных).

8) Осуществить морфологическую, цитологическую, гистологическую оценку трубчатых биоинженерных конструкций.

9) Исследовать биосовместимые материалы для создания 3D каркаса межклеточного матрикса для формирования трубчатых биоконструкций с использованием эпителиальных клеточных элементов.

10) Произвести поиск оптимальных модификаций 3D-каркаса с целью повышения биосовместимости, улучшения адгезии различных клеточных элементов и придания антисептических свойств. 

11) Изучить в эксперименте взаимодействие созданного 3D каркаса с тканями реципиента (лабораторные животные).

12) Изучить возможности интеграции в созданный 3D-каркас функционально активных клеток паращитовидных желез.

13) Создать тубулярные наноконструкции с использованием матрикса из биосовместимого материала с клеточной выстилкой с прототипированием конкретных органных структур.

14) Исследовать in vivo и in vitro созданный прототип органных структур.

Материалы проекта доложены на следующих мероприятиях:

1) Национальный конгресс «Пластическая хирургия, эстетическая медицина и косметология», 3-5 декабря 2015 г., Москва. Устный доклад. 

2) The European Cancer Congress 2015, 25-29 September, Vienna, Austria. Постерный и устный доклады.

3) 5-я Международная научная конференция «Новые оперативные технологии», 29-30 сентября 2015 г.Томск. Устный доклад. 

4) Пластическая хирургия в России. Конференция памяти академика Н.О.Миланова. 17-18 февраля 2016 г. Устный доклад.

5) III Междисциплинарный конгресс по заболеваниям головы и шеи. 25-27 мая 2015 г. Устный доклад.

6) Семинар-конференция 5-100 в Первом МГМУ им. И.М. Сеченова, стендовый доклад.2-я конференция памяти Н.О. Миланова "Пластическая хирургия в России. Актуальные вопросымикрохирургии", устный доклад.

7) 3-я Конференция памяти академика Н.О.Миланова "Пластическая хирургия в России. Актуальныевопросы микрохирургии", 16-18 февраля 2017 г., г.Москва, устный доклад.

8) IV Междисциплинарный конгресс по заболеваниям органов головы и шеи, устный доклад.Международный медицинский форум "Вузовская наука. Инновации", устный доклад.

9) 4-я Конференция памяти академика Н.О.Миланова "Пластическая хирургия в России. Актуальныевопросы микрохирургии", 14-15 февраля 2018 г., г.Москва, устный доклад.

Публикации по теме проекта.

1)  Решетов И.В., Старцева О.И., Истранов А.Л., Ворона Б.Н., Люндуп И.В., Гуляев И.В., Мельников Д.В., Штанский Д.В., Шевейко А.Н., Андреев В.А. Разработка трехмерного биосовместимого матрикса для задач реконструктивной хирургии. Анналы пластической, реконструктивной и эстетической хирургии, №1, 2016, с. 111-114.

2) I. V. Reshetov, O. I. Starceva, A. L. Istranov, B. N. Vorona, A. V. Lyundup, I. V. Gulyaev, D. V. Melnikov, D. V. Shtansky, A. N. Sheveyko and V. A. Andreev. Three-dimensional biocompatible matrix for reconstructive surgery. AIP Conf. Proc. 1760, 020056 (2016); http://dx.doi.org/10.1063/1.4960275

3) Решетов И.В., Старцева О.И., Истранов А.Л., Ворона Б.Н., Люндуп И.В., Гуляев И.В., Мельников Д.В., Штанский Д.В., Шевейко А.Н., Андреев В.А. Разработка трехмерного биосовместимого матрикса для задач реконструктивной хирургии. Анналы пластической, реконструктивной и эстетической хирургии, №2, 2016, с. 85-95.

4) Решетов И.В., Старцева О.И., Истранов А.Л., Ворона Б.Н., Люндуп И.В., Гуляев И.В., Мельников Д.В., Штанский Д.В., Шевейко А.Н., Андреев В.А. Разработка трехмерного биосовместимого матрикса в реконструктивной хирургии. Анналы пластической, реконструктивной и эстетической хирургии, №1, 2017, с. 131-132. 

5) Решетов И.В., Старцева О.И., Истранов А.Л., Ворона Б.Н., Люндуп И.В., Гуляев И.В., Мельников Д.В., Штанский Д.В., Шевейко А.Н. Разработка 3D-биосовместимого композитного матрикса для задач реконструктивной хирургии полых органов и тканей. Анналы пластической, реконструктивной и эстетической хирургии, №1, 2018, с. 99-100.

6) Reshetov I.V., Starceva O.I., Istranov A.L., Vorona B.N., Lyundup A.V., Melnikov D.V., Shtansky D.V., Sheveyko A.N. Creating a three-dimensional biocompatible matrix for use in reconstructive surgery. Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research. 2018 In Press.

7) Старцева О.И.,  Решетов И.В., Истранов А.Л., Ворона Б.Н., Люндуп И.В., Гуляев И.В., Мельников Д.В., Штанский Д.В., Шевейко А.Н. Композитная матрица на основе титановой сетки и коллагена - основа для создания прототипа полых органов. Анналы пластической, реконструктичной и эстетической хирургии. 2018, №3.